便攜式熒光定量PCR儀

前言

本標準按 GB/T 1.1-2009給出的規則起草。本標準由中國獸醫協(xié)會(huì )提出并歸口。本標準起草單位:中國動(dòng)物疫病預防控制中心、中國獸醫藥品監察所、中國農業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫研究所、中國農業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫研究所、北京海關(guān)。

非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法

1、范圍

本標準規定了非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的試劑、儀器和耗材、操作步驟、結果判定、實(shí)驗室生物安全等技術(shù)要求。

本標準適用于豬脾臟、淋巴結、血液等組織和血粉中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

2、規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是*的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB 19489 實(shí)驗室 生物安全通用要求

NY/T 541 獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規范

3、試劑

3.1DNA提取試劑

DNA提取試劑的配制見(jiàn)附錄A，或選取商品化的病毒DNA提取試劑盒并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。

3.2 2 × PCR緩沖液

2× PCR緩沖液的配制見(jiàn)附錄A。

3.3引物探針

3.3.1采用針對非洲豬瘟病毒VP72基因(核苷酸序列見(jiàn)附錄B)的引物及探針:

上游引物ASF-CADC-rPCRF:5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'

下游引物ASF-CADC-rPCRR:5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'

熒光探針ASF-CADC-Probe:5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'

3.3.2可以使用世界動(dòng)物衛生組織(OIE)在陸生動(dòng)物診斷技術(shù)和疫苗手冊(Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals)第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探針，并按照手冊中規定的檢測程序和判定標準操作:

上游引物ASF-OIE-rPCRF:5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'

下游引物ASF-OIE-rPCRR:

5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'

熒光探針ASF-OIE-Probe:

5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'

3.3.3使用國家農業(yè)行政主管部門(mén)批準的其他引物、探針，應對檢測程序和判定標準作相應調整。

3.4 陰性及陽(yáng)性對照

陰性及陽(yáng)性對照的制備方法見(jiàn)附錄C。

3.5 其他試劑

消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、無(wú)菌無(wú)核酸酶水、0.01mol/L PBS(pH7.2)。

消毒液配制見(jiàn)附錄A， 0.01mol/L PBS配制見(jiàn)附錄A。

4、儀器和耗材

分析天平(感量0.1 mg)、高速臺式冷凍離心機(高離心速度不低于12 000 r/min)、冰盒、實(shí)時(shí)熒光PCR儀及配套反應管(板)、組織研磨器、-20℃冰箱、可調移液器(2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL)、1.5mL離心管(無(wú)核酸酶)。

5、操作步驟

5.1 樣品采集及運輸

樣品采集及運輸按照NY/T 541的規定執行，采集豬的脾臟、淋巴結、血液等組織材料或血粉用于檢測，樣品應在冷藏條件下盡快運輸至實(shí)驗室，避免反復凍融。采樣時(shí)應穿戴個(gè)人生物安全防護裝備，實(shí)施現場(chǎng)消毒和廢棄物處理。

5.2 樣品處理

檢測前樣品應在二級生物安全柜中處理。取0.1g~0.2g組織或血粉，經(jīng)研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS(pH7.2)制成勻漿，經(jīng)10 000 r/min離心取上清;全血、血清樣品直接取1mL，置于1.5 mL離心管內蓋緊管帽。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。

5.3 樣品保存

采集或處理好的樣品在2℃~8℃條件下保存應不超過(guò)24 h;如需長(cháng)期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融(凍融不超過(guò)3次)。

5.4 病毒DNA提取

5.4.1 DNA提取應在樣本制備區內采用以下方法進(jìn)行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。

5.4.2 待檢樣品、陽(yáng)性對照和陰性對照的份數總和用n表示，取n個(gè)滅菌1.5 mL離心管，逐管編號。

5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分別加入待測樣品、陰性對照和陽(yáng)性對照各200μL，1份樣品換用1個(gè)吸頭，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下，13 000 r/min離心10 min。DNA提取液1見(jiàn)附錄A。

5.4.4 盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混勻器上震蕩混勻5 s。于4℃~25℃條件下，2 000 r/min離心10s。DNA提取液2見(jiàn)附錄A。

5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。

5.4.6 加入90μL無(wú)DNA酶的滅菌去離子水，13 000 r/min離心10 min，上清即為提取的DNA，-20℃保存備用。無(wú)DNA酶的滅菌去離子水見(jiàn)附錄A。

5.5 實(shí)時(shí)熒光PCR操作

5.5.1 在反應混合物配制區、樣品制備區和檢測區分別進(jìn)行5.5.2~5.5.4。

5.5.2 每個(gè)檢測反應體系需使用20μL實(shí)時(shí)熒光PCR反應液。根據5.4.2中設定的n值，按附錄D配制反應液，充分混勻后分裝，每個(gè)PCR反應管20μL。轉移PCR反應管至樣品制備區。

5.5.3 在上述5.5.2的反應管中分別加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管總體積達到25 μL，記錄反應管對應的樣品編號。蓋緊管蓋后，瞬時(shí)離心。

5.5.4 將5.5.3加樣后的反應管放入實(shí)時(shí)熒光PCR檢測儀內，記錄反應管擺放順序。選定5-羧基熒光素(FAM)作為報告基團，小溝結合物(MGB)為淬滅基團，反應參數設置如下:預變性95℃/3 min;95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45個(gè)循環(huán);在每次循環(huán)的60℃退火延伸時(shí)收集熒光。試驗結束后，根據收集的Ct值和熒光曲線(xiàn)判定結果。

6、結果判定

6.1 結果分析條件設定

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測閾值設定原則:閾值線(xiàn)超過(guò)陰性對照擴增曲線(xiàn)的高點(diǎn)，且相交于陽(yáng)性對照擴增曲線(xiàn)進(jìn)入指數增長(cháng)期的拐點(diǎn)，或根據儀器噪聲情況進(jìn)行調整。每個(gè)樣品反應管內的熒光信號到達設定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數即為Ct值。

6.2 結果描述及判定

當陽(yáng)性對照Ct值≤28.0且出現典型擴增曲線(xiàn)，陰性對照無(wú)Ct值無(wú)擴增曲線(xiàn)時(shí)，實(shí)驗成立，實(shí)例參考附錄E。當被檢樣品出現典型的擴增曲線(xiàn)且Ct值≤38.0時(shí)，判為非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性;被檢樣品無(wú)Ct值，判為非洲豬瘟病毒核酸陰性;對于Ct值＞38.0的樣品且出現典型的擴增曲線(xiàn)，應重檢，重檢仍出現上述結果的判為陽(yáng)性，否則判為陰性。